Study methods



	研究方法 Study methods

	一、标本采集 1. 剥查：查找被害虫、害螨为害的扭曲、畸形叶及芽中的螨类，用0号毛笔将螨挑入指形管中，同时放入采集标签。也可直接连叶片一起放入盛有保存液奥氏液（Oudemans fluid，70% 酒精∶冰醋酸∶甘油 = 87∶8∶5）或70-75%酒精的小玻瓶，短期内（30天内）带回实验室，在体视显微镜下检查，挑出螨制片。 2. 振动：振动或敲打植物枝叶，用白色蜡纸或瓷盘承接，将螨挑入小指形管。 3. 热源烘烤：对栖息于树皮、苔藓、地表枯枝落叶层、土壤、贮藏物和动物巢穴的采用贝氏漏斗（Berlese funnel）分离。更多采集保藏方法，可查看：Collecting and Preserving Insects and Mites. Techniques and Tools
	二、标本制作（一）玻片标本 1. 封片将保存液中的螨移入黑瓷板或小玻皿中，在体视显微镜下移入清洗液中(见3)浸泡数小时至数日(视螨体骨化程度而定)，用挑针（0号昆虫针末端敲扁，折弯成环）挑出螨体，用滤纸等去掉多余的浸液，将螨体放入载玻片上的封片液(见4)中（制临时片时用乳酸即可），整姿，盖上盖玻片，放在60瓦白炽灯或500瓦电热板上至气泡排出，用油漆笔在载玻片上、螨体周围画圈标出螨体位置，并写明采集标签（图1），即可在低倍显微镜下检查、调整螨体位置，然后置50℃左右恒温箱中干燥，1周后即可用于观察。　　图1.玻片标本标签示范　 2. 保藏在50℃温箱至完全干燥后，再在盖玻片周围封中性树胶，继续干燥1～2日即可在常温上保存，也可置干燥器中长期保存。 3. 清洗液内氏液 Nesbitt's fluid: 水合氯醛40克、浓盐酸2.5毫升、蒸馏水25毫升乳酸酚 Lactophenol: 乳酸50份、结晶酚25份、蒸馏水25份 4. 封片液霍氏液 Hoyer's medium: 水合氯醛100克、阿拉伯胶15克、甘油10毫升、蒸馏水25毫升霍氏液是水溶性封片胶，在潮湿地区和季节易出现滑片、起泡、变形等现象。用指甲油、油漆或中性胶等进行防水封片，有利长期保存。 PVA液 Heize medium: 聚乙烯醇10克、水合氯醛100克、90%乳酸35毫升、1%酚25毫升、甘油10毫升、蒸馏水40-60毫升可以克服霍氏液的缺点，无须进行防水封片，但清晰度较差，长期保存时会出现起花现象。（二）扫描电子显微镜标本 1. 前处理选样：将所需样品挑入装有70％酒精的小指形管中。固定：将小指形管在文火上煮3～5分钟，使样品舒展并初固定。用尖头吸管小心吸出酒精，注入2.5％戊二醛，浸没样品，固定3小时。清洗：将固定好的样品放入KQ-500H型超声波清洗仪清洗（50000赫兹，30秒钟）。脱水：将样品放于样品盒合中，依次置于以下浓度的酒精瓶中，每梯度需30分钟：70％酒精→75％酒精→85％酒精→95％酒精→100％酒精→100％酒精。 2. 临界点干燥采用SAMDRI PVI－3B临界点干燥仪。预热：插入电源（115V／60Hz），预热5分钟。载物：将样品盒置入临界点干燥仪样品室，加100％酒精覆盖，关闭样品室。冷却：打开CO₂钢瓶，通入CO₂，使样品室温度降至0℃。处理时间不超过3分钟；冷却至0℃后打开填充阀，进行CO₂填充（一般为2分钟）。清洗：打开清洗阀，在通入CO₂的同时逐渐排出酒精，直至全部排干，温度控制在10℃以下。清洗时间根据样品中酒精量而定。用滤纸置于排气管口检测酒精是否排干，滤纸湿的表明未排干。加热：所有的酒精被CO₂代替后，开始加热，当温度达39-41℃、压力达1200帕时，加热灯熄灭，再保持平衡4分钟。降压：逐渐降低样品室压力，每分钟降压100帕，直至0帕，然后打开样品室，取出样品。粘台：在体视显微镜下，用0号毛笔小心挑取标本，并按需要粘在样品台上（经过临界点干燥的样品极脆，应小心操作）。镀膜：采用JFC－1200型真空镀膜仪。将样品台放入镀膜仪中，接通电源，抽真空到5帕以下，然后开始镀膜，时间为1分钟。
	三、标本观察 1. 玻片标本将玻片标本置于光学显微镜下，仔细观察螨的背面、腹面、颚体和足的形态特征；特别注意观察颚体、生殖区、螯肢、须肢、足、前跗节以及须肢、足上着生的各种毛和感棒的形态。例如: 体背面: 表皮、普通毛、感毛和隙孔等数量和形态。体腹面: 表皮、普通毛、感毛和隙孔等数量和形态。外生殖器: 雌雄两性的形态与构造。颚体：螯肢、颚下体和须肢的形态构造，须肢转节、股节、膝节、胫节、跗节的形态构造，以及各节上的普通毛、荆毛、感棒和爪等的数量和形态。足：基节、转节、股节、膝节、胫节、跗节的形态构造，以及各节上普通毛、感毛、感棒等的数量和形态。 2. 扫描电子显微镜标本将样品台放入电子显微镜样品室，在15kv下观察，并对重要特征拍照。 3. 显微镜类型、构造和使用方法参考http://www.cella.cn/book/02/01.htm和http://www.poweb.cn/content/view/97/
	四、标本测量(玻片标本) 1. 物镜标定Calibration 在目镜内装目镜测微尺Ocular micrometer，将载物台测微尺Stage micrometer放在载物台上。调节载物台，使目镜和载物台两测微尺的0端刻度完全重叠，然后再找出第二个刻度重叠处，记录两测微尺在重合处之间的刻度数。则：目镜每小格长度(单位：微米)＝10 × 载物台测微尺格数 ÷ 目镜测微尺格数注：不同物镜要分别标定。 2. 测量内容体长：指躯体长度，不含颚体。体宽：指躯体在足Ⅱ与Ⅲ之间的最大距离。螯长：指螯肢后端至动趾末端的距离。须肢长：指须肢转节基部到须肢跗节末端的距离。毛及感棒长：指毛及感棒着生基部到其末端的距离。足长：指自足基部（一般为转节）到足跗节末端的距离。测量单位：微米。
	五、标本绘图、拍照 1. 绘图描图：在光学显微镜描图仪(Camera lucida)下用HB铅笔绘制草图，并在油镜(100X)下核准。复墨：用0.3、0.5和0.7毫米绘图笔复墨直接在草图上复墨，待墨迹凉干后，擦除铅笔痕迹。也可将硫酸纸覆盖于草图上，用绘图笔复墨。后处理：用扫描仪将图扫描（解析度设置为600dpi）到电脑内，用Adobe Photoshop软件进行修改排版，擦除污痕，加入图注。 2. 拍照对重要形态特征如：外生殖器，表面结构，感棒等进行拍照，设置为灰度即可，不必用彩色。后处理：解析度设置为300dpi，扫描到电脑内，进行修改、排版、加图注。

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	研究方法 Study methods

	一、标本采集 1. 剥查：查找被害虫、害螨为害的扭曲、畸形叶及芽中的螨类，用0号毛笔将螨挑入指形管中，同时放入采集标签。也可直接连叶片一起放入盛有保存液奥氏液（Oudemans fluid，70% 酒精∶冰醋酸∶甘油 = 87∶8∶5）或70-75%酒精的小玻瓶，短期内（30天内）带回实验室，在体视显微镜下检查，挑出螨制片。 2. 振动：振动或敲打植物枝叶，用白色蜡纸或瓷盘承接，将螨挑入小指形管。 3. 热源烘烤：对栖息于树皮、苔藓、地表枯枝落叶层、土壤、贮藏物和动物巢穴的采用贝氏漏斗（Berlese funnel）分离。更多采集保藏方法，可查看：Collecting and Preserving Insects and Mites. Techniques and Tools
	二、标本制作（一）玻片标本 1. 封片将保存液中的螨移入黑瓷板或小玻皿中，在体视显微镜下移入清洗液中(见3)浸泡数小时至数日(视螨体骨化程度而定)，用挑针（0号昆虫针末端敲扁，折弯成环）挑出螨体，用滤纸等去掉多余的浸液，将螨体放入载玻片上的封片液(见4)中（制临时片时用乳酸即可），整姿，盖上盖玻片，放在60瓦白炽灯或500瓦电热板上至气泡排出，用油漆笔在载玻片上、螨体周围画圈标出螨体位置，并写明采集标签（图1），即可在低倍显微镜下检查、调整螨体位置，然后置50℃左右恒温箱中干燥，1周后即可用于观察。　　图1.玻片标本标签示范　 2. 保藏在50℃温箱至完全干燥后，再在盖玻片周围封中性树胶，继续干燥1～2日即可在常温上保存，也可置干燥器中长期保存。 3. 清洗液内氏液 Nesbitt's fluid: 水合氯醛40克、浓盐酸2.5毫升、蒸馏水25毫升乳酸酚 Lactophenol: 乳酸50份、结晶酚25份、蒸馏水25份 4. 封片液霍氏液 Hoyer's medium: 水合氯醛100克、阿拉伯胶15克、甘油10毫升、蒸馏水25毫升霍氏液是水溶性封片胶，在潮湿地区和季节易出现滑片、起泡、变形等现象。用指甲油、油漆或中性胶等进行防水封片，有利长期保存。 PVA液 Heize medium: 聚乙烯醇10克、水合氯醛100克、90%乳酸35毫升、1%酚25毫升、甘油10毫升、蒸馏水40-60毫升可以克服霍氏液的缺点，无须进行防水封片，但清晰度较差，长期保存时会出现起花现象。（二）扫描电子显微镜标本 1. 前处理选样：将所需样品挑入装有70％酒精的小指形管中。固定：将小指形管在文火上煮3～5分钟，使样品舒展并初固定。用尖头吸管小心吸出酒精，注入2.5％戊二醛，浸没样品，固定3小时。清洗：将固定好的样品放入KQ-500H型超声波清洗仪清洗（50000赫兹，30秒钟）。脱水：将样品放于样品盒合中，依次置于以下浓度的酒精瓶中，每梯度需30分钟：70％酒精→75％酒精→85％酒精→95％酒精→100％酒精→100％酒精。 2. 临界点干燥采用SAMDRI PVI－3B临界点干燥仪。预热：插入电源（115V／60Hz），预热5分钟。载物：将样品盒置入临界点干燥仪样品室，加100％酒精覆盖，关闭样品室。冷却：打开CO₂钢瓶，通入CO₂，使样品室温度降至0℃。处理时间不超过3分钟；冷却至0℃后打开填充阀，进行CO₂填充（一般为2分钟）。清洗：打开清洗阀，在通入CO₂的同时逐渐排出酒精，直至全部排干，温度控制在10℃以下。清洗时间根据样品中酒精量而定。用滤纸置于排气管口检测酒精是否排干，滤纸湿的表明未排干。加热：所有的酒精被CO₂代替后，开始加热，当温度达39-41℃、压力达1200帕时，加热灯熄灭，再保持平衡4分钟。降压：逐渐降低样品室压力，每分钟降压100帕，直至0帕，然后打开样品室，取出样品。粘台：在体视显微镜下，用0号毛笔小心挑取标本，并按需要粘在样品台上（经过临界点干燥的样品极脆，应小心操作）。镀膜：采用JFC－1200型真空镀膜仪。将样品台放入镀膜仪中，接通电源，抽真空到5帕以下，然后开始镀膜，时间为1分钟。
	三、标本观察 1. 玻片标本将玻片标本置于光学显微镜下，仔细观察螨的背面、腹面、颚体和足的形态特征；特别注意观察颚体、生殖区、螯肢、须肢、足、前跗节以及须肢、足上着生的各种毛和感棒的形态。例如: 体背面: 表皮、普通毛、感毛和隙孔等数量和形态。体腹面: 表皮、普通毛、感毛和隙孔等数量和形态。外生殖器: 雌雄两性的形态与构造。颚体：螯肢、颚下体和须肢的形态构造，须肢转节、股节、膝节、胫节、跗节的形态构造，以及各节上的普通毛、荆毛、感棒和爪等的数量和形态。足：基节、转节、股节、膝节、胫节、跗节的形态构造，以及各节上普通毛、感毛、感棒等的数量和形态。 2. 扫描电子显微镜标本将样品台放入电子显微镜样品室，在15kv下观察，并对重要特征拍照。 3. 显微镜类型、构造和使用方法参考http://www.cella.cn/book/02/01.htm和http://www.poweb.cn/content/view/97/
	四、标本测量(玻片标本) 1. 物镜标定Calibration 在目镜内装目镜测微尺Ocular micrometer，将载物台测微尺Stage micrometer放在载物台上。调节载物台，使目镜和载物台两测微尺的0端刻度完全重叠，然后再找出第二个刻度重叠处，记录两测微尺在重合处之间的刻度数。则：目镜每小格长度(单位：微米)＝10 × 载物台测微尺格数 ÷ 目镜测微尺格数注：不同物镜要分别标定。 2. 测量内容体长：指躯体长度，不含颚体。体宽：指躯体在足Ⅱ与Ⅲ之间的最大距离。螯长：指螯肢后端至动趾末端的距离。须肢长：指须肢转节基部到须肢跗节末端的距离。毛及感棒长：指毛及感棒着生基部到其末端的距离。足长：指自足基部（一般为转节）到足跗节末端的距离。测量单位：微米。
	五、标本绘图、拍照 1. 绘图描图：在光学显微镜描图仪(Camera lucida)下用HB铅笔绘制草图，并在油镜(100X)下核准。复墨：用0.3、0.5和0.7毫米绘图笔复墨直接在草图上复墨，待墨迹凉干后，擦除铅笔痕迹。也可将硫酸纸覆盖于草图上，用绘图笔复墨。后处理：用扫描仪将图扫描（解析度设置为600dpi）到电脑内，用Adobe Photoshop软件进行修改排版，擦除污痕，加入图注。 2. 拍照对重要形态特征如：外生殖器，表面结构，感棒等进行拍照，设置为灰度即可，不必用彩色。后处理：解析度设置为300dpi，扫描到电脑内，进行修改、排版、加图注。